CST磷酸化抗体小课堂：经典NF-kB信号通路的热门研究靶点和高引用抗体
业内提到磷酸化抗体，就不得不想到CST。CST是一家提供生产特色的信号转导检测用抗体及磷酸化抗体、ELISA试剂盒、激酶等产品的公司。公司专注应用系统生物学研究领域，特别是癌症相关研究领域，使用高特异性和高稳定性抗体。董增军（Jay Dong）为CST（全球）副总裁兼亚太总经理，也是独资子公司CST中国（赛信通）的总经理。
而说起CST在免疫和炎症相关信号通路的研究产品，那可称得上个个经典，广受欢迎。其中，NF-κB/Rel家族的转录因子在免疫和炎性反应中扮演了重要的角色。CST中国也曾在自己的公众号平台上，梳理过这个信号通路中的热门靶点和高引用抗体的知识点。
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CST赛信通关于磷酸化抗体Autophagy Signaling信号通路图
首先，我们一起看看几点概论吧。
哺乳动物中该家族一共有5个成员：RelA（p65），c-Rel，RelB，NF-kB1(p105/p50)和NF-kB2(p100/p52)。这些蛋白均形成二聚体转录因子，它们控制的基因调控众多生物学过程如先天性和获得性免疫、炎症、应激反应、B细胞形成、淋巴器官的生成等。p105 和 p100 在蛋白酶体的作用下分别裂解形成p50 和 p52。Rel（RelA／c-Rel或RelA或RelB，见下图长方形标示区）与p50和／或p52形成二聚体，此复合体能够结合到DNA上调控转录。在未接受刺激的时候，IκB抑制因子促使NF-κB?以非活性状态停留于细胞质中。刺激信号经过IKK，然后其能够诱导 IκB 蛋白的磷酸化, 这就使IκB能够快速地经过泛素化-蛋白酶通路降解从而释放出NF-κB（见下图椭圆标示区），激活的NF-κB从而入核调控基因的表达。
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NF-kB通路概览
IκB家族的主要相关成员是IκBα, IκBβ, IκBε，Bcl-3和IκBζ。前三个使NF-κB维持在胞浆中，并对信号响应十分重要。而后两个是诱导表达的非典型IκB蛋白。另外小鼠里的一个NFKB1基因的可变剪接转录本编码了IκBγ，但对其功能了解的不多。大部分激活因子一般通过使IκB磷酸化并随后被降解的通路来激活NF-κB。此通路中最重要的步骤是激活高分子量的IκB激酶（IKK）复合体，该复合体催化的反应由三个紧密相关的IKK亚基参与完成，IKKα 与 IKKβ 作为激酶复合体的催化单元，而IKKγ（又叫NEMO）作为激酶复合体的调控单元。随着研究的深入，两个IKKα和IKKβ的同源蛋白得到了鉴定，分别是IKKε （也叫IKK-i）和TBK-1（也叫T2K 或 NAK）, 激活这些激酶中的任何一个都能导致NF-κB的激活。IKKε在N-末端包含一个与IKKα或IKKβ有30%相似度的激酶区域。IKKε主要在免疫细胞中表达，并在免疫应答中发挥了特殊的作用。
在经典的通路中，NF-κB/Rel与IκB结合并被其抑制。促炎症因子，LPS，生长因子和抗原受体激活IKK复合体(包含IKKβ，IKKα和IKKγ／NEMO)，后者磷酸化IκB蛋白，导致IκB蛋白被泛素化和溶酶体降解，于是NF-κB被释放出来。活化的NF-κB进一步被磷酸化激活并转移入核，NF-κB或单独或与其他转录因子如AP-1，Ets和Stat结合诱导靶基因的表达。
在非传统NF-kB途径中，NF-κB2p100/RelB复合体以未激活的状态停留在胞浆中。一些受体的激活，如LTβR，CD40和BR3激活激酶NIK，激活的NIK而后又激活IKKα复合体，后者对NF-κB2p100的羧基端氨基酸进行磷酸化。磷酸化的NF-κB2 p100被泛素化并被蛋白酶体降解为NF-κB2 p52。最后形成具有完整转录活性的NF-κB2 p52/RelB复合体，转移进入细胞核并起始靶基因转录。
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CST赛信通关于磷酸化抗体MAP Kinase Signaling信号通路图
接下来，我们再一起看下CST中国（赛信通）梳理的 IKK和IκB的知识点。
IKKα与β对于特定的NF-κB通路作用是不同的。在经典途径中，如TNFR1的下游，IKKβ对下游的IκBα和IκBβ是必需的，且也是充分的。但通常IKKα却不是磷酸化所必需的，其能介导相应IκB的磷酸化，并在经典通路中的转录反应中起到重要作用。此外，在非经典途径中，IKKα却起到了独一无二的作用。其磷酸化p100抗体，从而导致其进一步加工变为p52。IKK的激活依赖于特定位点的磷酸化： IKKβ活性环中的 Ser177和Ser181位点以及IKKα中的Ser176 和 Ser180 位点，这些位点的磷酸化引起蛋白构象的变化从而激活激酶。IKKα和IKKβ通过c末端的NBD结构域与IKKγ／NEMO结合。基于以往的研究，科学家提出了一个经典途径里IKK激活的模型。在未激活状态下，IKKs与IKKγ／NEMO结合而处于失活状态。当受到刺激后，IKKγ／NEMO结合RIP蛋白从而导致构象变化，这就使IKK的T环区域的丝氨酸被磷酸化。这样激活的IKK接着磷酸化下游的底物如IκBs，IKKβ的Ser740位点和IKKγ／NEMO的Ser68位点。这些磷酸化事件使IKK复合物变为张开状态，从而使磷酸能够进入。然后通过IKK的T环丝氨酸的去磷酸化从而终止激酶活性。在非经典途径里，NIK直接磷酸化IKKα的T环里的丝氨酸。
IκBα可通过其Ser32和Ser36位点的磷酸化来参与NF-κB激活。IκBβ和IκBε的调控与IκBα类似, 然而这些蛋白的磷酸化与降解从动力学上来看更慢。IκBβ可在Ser19和Ser23位点磷酸化，而IκBε的磷酸化位点是Ser18 和Ser22。Bcl-3比较独特的地方是其含有转录激活结构域TAD，研究发现其可以在核内与含有p50和p52的同源或异源二聚体结合。IκBζ不是组成性表达，但会响应IL-1和TLR4配体而上调表达。
CST有针对IKK和IκB家族所有成员的高品质抗体，磷酸化抗体的性能突出，引用文献的数量在业内也是领先的。
同时，CST中国（赛信通）也曾在公众号上温馨提醒过做NF-kB信号通路检测的各位小伙伴，由于IKK的磷酸化是一个进展很快的事件，因此，太长时间的处理会导致丢失磷酸化信号。
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CST赛信通关于磷酸化抗体p53 Signaling信号通路图
最后，CST中国（赛信通）还谈到了NF-κB p65。
众多研究已报道了多种激酶可以磷酸化NF-κB p65（如下图所示），这是通过PhosphoSitePlus?蛋白质翻译后修饰数据库查询到人的NF-κB p65上的磷酸化位点。这些NF-κB p65的磷酸化事件要么发生在胞浆里、要么发生在核内，具体取决于刺激的类型以及细胞类型，因此，可以根据具体情况用WB检测总样本中总的和磷酸化的NF-κBp65的量，或者用WB或IF分别检测胞浆和胞核中总的和磷酸化的NF-κB p65的量。
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人p65蛋白上众多的磷酸化修饰位点
不同位点的修饰对于p65的活性也是各异的。如很多激酶可以在Ser536位磷酸化p65，这一般会增强p65的转录激活潜力。在接受TNFα或I型HTLV的Tax的蛋白刺激后，激活的IKK复合物会导致p65的Ser536位点磷酸化。有趣的是TNFα介导的Ser536位点磷酸化需要IKKβ，而Tax介导的磷酸化则需要IKKα。另外Ser468位点的磷酸化参与了p65的泛素化及降解，且其还会抑制p65的转录活性。T细胞协同刺激和Calyculin A处理都能增加Ser468位点的磷酸化程度。此外，Lys310位的乙酰化可以影响p65与IkB的组装、DNA结合及转录活性。在该位点的甲基化会减弱NF-kB通路的信号转导。
NF-κB p65抗体作为CST免疫产品线的核心产品，引用文献众多，说明其性能是非常可信可靠的。
据了解，为了方便研究人员研究复杂的信号通路，CST可以提供20ul的Microsize抗体，总蛋白和磷酸化蛋白配对的抗体对，以及针对某一信号通路关键蛋白或某一蛋白多种压型或修饰的小包装抗体试剂盒。其性价比高，组合科学，降低了研究门槛，帮助研究人员筛选更多未知，感兴趣或者有需要的小伙伴，都可以登陆官方网站搜搜看。还有更多关于免疫组化、磷酸化抗体等的知识点可以免费get哦~
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